在蛋白质微观世界中，水分子广泛存在于蛋白空腔与相互作用界面中。对于G蛋白偶联受体（GPCR）这类高度动态的膜蛋白而言，水分子在受体稳定、构象转换和激活过程中的作用已受到长期关注。然而，在特定受体中，这些水分子如何组织成连续网络，并进一步参与跨膜信号传递和G蛋白选择性调控，仍需要更多直接证据。GPR174是免疫稳态的关键调节因子，其编码基因与Graves病、Addison病等自身免疫疾病相关。该受体被内源性脂质配体LysoPS激活，通过偶联不同G蛋白发挥复杂的免疫调节作用——Gs信号通过促进cAMP累积进而促进T细胞耗竭和免疫抑制；与之相反，Gi信号则可通过降低胞内cAMP浓度增强效应T细胞分化和细胞毒功能。特别是清华大学祁海教授团队在Nature发表的研究发现，GPR174 可响应趋化因子CCL21，并通过Gi相关信号调节B细胞迁移和生发中心定位，从而参与体液免疫应答的性别差异【1】。此前多项研究报导了GPR174与Gs蛋白的复合物结构，分辨率在2.8–3.1 Å之间，揭示了LysoPS的识别模式与Gs耦联及受体激活机制【2-4】。然而，这一分辨率范围不足以识别受体跨膜核心中连续、有序的结构水分子网络。因此，LysoPS激活GPR174后，其内部如何形成一个连续的、支持信号传递的水分子网络，而这一水分子网络又如何参与对不同G蛋白（如Gs与Gi）通路的选择性调控，尚缺乏高分辨率的结构机制解释。近日，浙江大学医学院张岩教授团队在PLOS Biology发表题为Structured water molecules drive activation and G protein selectivity in the GPR174 receptor的研究论文。该研究聚焦免疫稳态相关受体GPR174，通过高分辨率冷冻电镜结构、分子动力学模拟以及功能实验，揭示了受体内部一条由结构水分子介导的连续氢键网络。这一网络不仅参与GPR174的激活，还进一步影响其对不同G蛋白通路的选择性调控。解析LysoPS激活状态下的GPR174内部水分子网络GPR174内部的水分子网络状态与受体激活及效应蛋白耦联密切相关。在明确LysoPS激活GPR174的信号通路特征后，研究团队获得了LysoPS激活状态下GPR174分别结合Gs和Gi的冷冻电镜结构，分辨率分别达到2.0 Å和3.4 Å。近年来，A类GPCR–Gs复合物的冷冻电镜结构分辨率已推进至约2 Å水平，例如CCK1R–Gs复合物结构达到1.95 Å5。在本研究中，解析所得2.0 Å的GPR174–Gs复合物结构提供了高质量的电子密度图，使得系统识别受体内部有序排列的结构水分子成为可能。基于此，研究团队清晰观测到14个有序水分子，为直观解析受体内部的水分子网络奠定了物质基础。水分子网络如何驱动GPR174激活与G蛋白选择性发现一：水分子是信号传递的关键组成部分研究团队通过高分辨率结构发现，GPR174内部的水分子并非零散分布，而是沿受体跨膜核心形成了连续排布的水分子网络。其中，5个水分子位于配体结合口袋，参与稳定LysoPS的极性头部；8个水分子连接钠离子结合口袋、NPxxY和DRY等关键激活基序；另有1个水分子WG1位于胞内G蛋白结合界面。这样一条由结构水分子介导的氢键网络，将配体识别、受体激活基序和G蛋白结合界面联系起来。功能实验进一步显示，当研究团队突变这些水分子的关键锚定残基后，GPR174介导的信号明显减弱。这说明，内部水分子网络不仅是结构中的局部稳定因素，也参与维持受体活化构象和跨膜信号传递。发现二：水分子网络参与G蛋白选择性调控Gs和Gi是 G 蛋白的两种主要亚型，通过调控腺苷酸环化酶（AC）活性影响细胞内cAMP水平，从而调控下游 PKA 等信号，在T和B细胞中发挥重要且差异化的作用，并且Gi通路通常占据主导地位。研究人员进一步比较了GPR174分别结合Gs和Gi的复合物结构。结果显示，在Gs结合状态下，Gαs的α5螺旋插入受体胞内腔更深；而在Gi复合物中，Gαi的α5螺旋构象相对表浅。这一构象差异很好地解释了LysoPS激活 GPR174 后偶联Gi的活性明显弱于Gs的原因。在GPR174–Gs结构中，界面水分子WG1连接DRY基序中的R1163.50与Gαs α5螺旋，形成水介导氢键桥。与此同时，TM2–TM3形成的疏水口袋，以及R1153.49–D1344.42盐桥，共同塑造了更有利于Gs结合的胞内界面。相比之下，在Gi复合物中，内部水分子虽然未能在当前分辨率下被直接解析，但分子动力学模拟提示相应水分子结合位点仍存在且水分子与残基之间的相互作用更加动态。这说明，GPR174对不同G蛋白的选择性不仅取决于配体识别，还受到胞内界面构象、疏水相互作用、盐桥以及水介导氢键网络的共同调控。发现三：5.58位点残基调控受体内部空腔容纳水分子的能力基于对GPR174的机制解析，研究团队进一步将视野拓展至A类GPCR家族，提出了三个水分子富集空腔的结构框架，即CWC（conserved water cavity，保守水空腔）、JWC（junctional water cavity，连接水空腔）和EWC（extended water cavity，延伸水空腔）。其中，CWC位于钠离子结合口袋附近，JWC位于Y7.53附近并连接保守激活基序，EWC位于TM5和TM6的胞内端附近。在A类GPCR家族的序列与结构比较中进一步发现，5.58位点是决定EWC几何特征和容纳水分子能力的关键位置。这一位点在A类GPCR中大致分为两类：约15%的受体在该位置保留较小的非带电极性残基，如天冬酰胺、苏氨酸和半胱氨酸；而约75%的受体则由体积较大的芳香族残基，如酪氨酸和苯丙氨酸占据。前者更容易形成较大的水可及空间，从而允许水分子进入并参与支撑活化构象；后者则会通过空间位阻限制水分子进入，并由侧链本身提供构象支撑。这一结果提示，GPR174中观察到的水分子网络调控机制可能具有更广泛的参考意义，并为理解A类GPCR内部空腔如何支持受体激活提供了新的结构框架。水分子网络为GPCR激活与信号调控提供新的机制视角这项研究不仅解释了LysoPS激活后GPR174内部如何通过连续氢键网络实现跨膜信号传递，也为其G蛋白选择性提供了新的结构依据。更重要的是，该研究将结构水分子从受体内部的辅助性结构要素，进一步推进为理解GPCR激活和信号选择性的重要机制变量。这项工作的启发并不只限于GPR174本身。未来在GPCR靶向药物设计中，研究者或许不仅需要考虑药物如何与受体残基直接相互作用，也需要进一步关注：小分子是否会改变受体内部空腔的水分子占据状态，是否能够稳定或扰动特定的水介导氢键网络。对于理解受体功能和设计调控受体状态的小分子而言，内部水分子网络可能提供一层值得重视的结构信息。浙江大学医学院张岩教授、王伟伟研究员和毛春友研究员为该论文共同通讯作者。浙江大学博士生董映君、浙江大学医学院附属邵逸夫医院助理研究员席昆、杭州医学院硕士生张雅芝、浙江大学博士生薛建恒和沈丹丹为本文共同第一作者。此外，清华大学祁海教授和博士后赵若竹对本论文提供了重要支持。原文链接：https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003447
参考文献
1. Zhao R, Chen X, Ma W, et al. A GPR174-CCL21 module imparts sexual dimorphism to humoral immunity. Nature. 2020;577(7790):416-420. doi:10.1038/s41586-019-1873-02. Nie Y, Qiu Z, Chen S, et al. Specific binding of GPR174 by endogenous lysophosphatidylserine leads to high constitutive Gs signaling. Nat Commun. 2023;14(1):5901. Published 2023 Sep 22. doi:10.1038/s41467-023-41654-33. Liang J, Inoue A, Ikuta T, et al. Structural basis of lysophosphatidylserine receptor GPR174 ligand recognition and activation. Nat Commun. 2023;14(1):1012. Published 2023 Feb 23. doi:10.1038/s41467-023-36575-04. Liu G, Li X, Wang Y, Zhang X, Gong W. Structural basis for ligand recognition and signaling of the lysophosphatidylserine receptors GPR34 and GPR174. PLoS Biol. 2023;21(12):e3002387. Published 2023 Dec 4. doi:10.1371/journal.pbio.30023875. Mobbs JI, Belousoff MJ, Harikumar KG, et al. Structures of the human cholecystokinin 1 (CCK1) receptor bound to Gs and Gq mimetic proteins provide insight into mechanisms of G protein selectivity. PLoS Biol. 2021;19(6):e3001295. Published 2021 Jun 4. doi:10.1371/journal.pbio.3001295
