250多个风险基因之后，为什么还解释不了ASD？
过去十余年的全外显子组测序（whole-exome sequencing, WES）和全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）显著推进了ASD遗传学研究。罕见的新发变异（de novo variants）、蛋白功能损伤变异以及一批大效应风险基因陆续被发现。
困难也随之变得更加清楚。
如果ASD只由少数基因控制，那么从基因到通路、再到治疗靶点的路线相对直接。但ASD表现出很强的遗传异质性（genetic heterogeneity）：不同患者可能携带完全不同的致病或风险变异，同一个基因的不同变异也可能对应明显不同的临床表现。
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这些看起来彼此无关的风险基因，在细胞中是否真的彼此无关？ |
毕竟基因并不直接完成绝大多数细胞功能。很多功能最终由蛋白质以及蛋白复合物（protein complex）承担。一个蛋白可能同时与十几个甚至几十个蛋白发生相互作用，而一次氨基酸改变，也未必让蛋白彻底“失效”，它可能只破坏其中某一个结合界面，或者意外增强另一种相互作用。
这正是这项研究切入的地方。
100个风险蛋白，最终连出了1881条相互作用
研究人员首先选择了100个高可信度ASD风险蛋白，通过亲和纯化-质谱（affinity purification–mass spectrometry, AP-MS）系统测量它们的蛋白相互作用。
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最终获得的网络连接了100个ASD风险蛋白和1074个高可信度互作蛋白，共包含1881条蛋白相互作用。 |
更值得注意的是，其中87%的相互作用此前没有被报道过；每一个ASD风险蛋白的互作蛋白数量中位数为11。
换句话说，过去我们看到的主要是100个“基因节点”，现在这些节点背后突然展开了一张包含上千个蛋白的功能网络。
但这里马上会出现一个方法学问题：实验最初是在HEK293T细胞中完成的，而ASD显然是神经发育障碍。这张网络会不会只是某种实验系统中的蛋白互作现象？
研究人员进行了多层验证。
去掉原本的hcASD蛋白后，剩余1043个互作蛋白在脑组织中仍表现出明显的表达特征。更具体地说，在524个人脑样本中，这些互作蛋白与hcASD基因表达水平之间的决定系数达到 R²=0.81，P<1×10⁻¹⁵；沿脑发育时期观察，两组基因表达变化的Spearman相关系数达到 ρ=0.946。
而且，这些互作蛋白富集ASD相关的新发有害变异和ASD风险基因，却没有观察到类似的精神分裂症风险基因富集。
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这让一个值得思考的观点浮现出来：疾病相关信息可能并不只存在于“哪个基因发生突变”，还存在于这个基因连接到了哪些蛋白。 |
当研究视角从“基因”转向“网络”，最相关的细胞也发生了变化
此前很多ASD遗传学研究把注意力集中在已经分化的神经元，尤其是兴奋性神经元（excitatory neurons, ENs）。
这项研究得到的结果略有不同。
如果仅观察ASD风险基因，信号依然主要出现在分化后的兴奋性神经元；但当研究人员把风险蛋白的相互作用网络纳入分析后，富集中心开始向更早期的神经祖细胞（neural progenitor cells, NPCs）移动，尤其是产生兴奋性神经元的祖细胞。
而且，这一结果能够在3套独立的产前人脑单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据中重复出现。
这可能改变我们理解ASD的一种方式。
问题也许并不仅仅出在“成熟神经元工作得是否正常”，而可能更早发生在：祖细胞以什么速度增殖、什么时候停止增殖、什么时候开始分化，以及最终产生多少种不同类型的神经元。
时间本身，可能就是神经发育疾病表型的一部分。
这些风险基因并不是100座孤岛：31%彼此直接相连
网络结构进一步强化了这种“汇聚”特征。
在100个hcASD蛋白中，31%能够与其他hcASD蛋白发生相互作用；35%的互作蛋白同时连接两个或更多hcASD蛋白。
网络并没有形成大量彼此独立的小模块，而呈现较高的连接密度和较低的模块化程度。研究人员还发现多个风险蛋白共同连接到Sin3复合物、Mediator复合物和PAF1复合物等与转录调控、神经干细胞状态、祖细胞增殖和神经元迁移有关的蛋白系统；此外，17个hcASD蛋白同时连接到AP2相关的网格蛋白介导内吞复合物（clathrin-mediated endocytosis complex）。
这里隐藏着一个很重要的研究逻辑：
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如果很多单个基因的统计关联还没有达到严格的全基因组显著性水平，但这些基因编码的蛋白却反复出现在同一个疾病相关蛋白复合物中，那么蛋白网络本身可能成为发现疾病机制、甚至寻找新风险基因的另一层证据。 |
这并不能取代遗传学证据，却可能帮助决定“下一步最值得研究谁”。
AlphaFold在这里做的，不只是预测蛋白长什么样
仅知道两个蛋白出现在同一个复合物里还不够。研究人员进一步使用AlphaFold-Multimer，希望区分哪些蛋白可能直接接触，以及它们究竟通过什么结构界面结合。
当平均界面预测模板建模评分（mean interface predicted template modeling score, mean ipTM）超过0.5时，实验支持的ASD蛋白互作相对于随机组合出现了大约5～10倍的富集。
按照这一标准，研究获得113个高可信度直接相互作用，其中49个此前未被识别。需要注意的是，这组预测的假发现率（false discovery rate, FDR）仍约为10%～20%，所以结构预测并不能被直接等同于生物学事实。
研究人员随后用NanoLuc分裂荧光素酶相互作用实验进行验证，在37对候选蛋白中确认了12对直接结合，约占32%。
这也是这项工作的一个方法学亮点：不是单独依赖遗传学、蛋白质组学或人工智能结构预测，而是让不同证据相互约束。
一个此前并不起眼的DCAF7，为什么成了网络中心？
随后，研究人员寻找能够同时连接大量ASD风险蛋白的“枢纽互作蛋白”（hub interactors）。
共有7个蛋白能够连接至少8个hcASD蛋白。其中，DCAF7是唯一一个在已有互作网络中同时表现出明显ASD风险基因富集的枢纽蛋白。
进一步分析发现，DCAF7与DYRK1A以及KIAA0232可以组成一个此前缺乏系统功能认识的蛋白复合物。三者共有126个互作蛋白，而这些蛋白再次富集ASD风险相关信息。
但网络关联并不意味着因果。
因此，研究人员继续在非洲爪蟾和人源神经祖细胞中验证。敲除（knockout, KO）dcaf7或kiaa0232，与敲除dyrk1a产生相似结果，都导致前脑端脑区域缩小；在人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）来源的神经祖细胞中，降低DCAF7或KIAA0232表达会减少Ki67阳性祖细胞，提示细胞增殖受损。
更重要的是，无论降低DCAF7、DYRK1A还是KIAA0232，几个关键神经发生转录因子：PAX6、FOXG1和SOX2，都出现下调。
于是，一个原本由网络分析提出的候选复合物，开始获得跨物种、跨模型的功能证据。
突变最值得警惕的，可能不是“蛋白坏了”，而是“朋友换了”
接下来是整项研究最值得关注的部分。
研究人员分析了来自患者的54个有害新发错义变异（damaging de novo missense variants），这些变异分布于30个hcASD蛋白中，并比较突变蛋白与野生型蛋白的相互作用。
结果发现253条蛋白相互作用发生显著改变。
其中136条属于丢失或减弱的相互作用，对应95个独特互作蛋白。但并不是所有变化都是“失去”。部分突变反而获得或者增强了新的蛋白相互作用。
更有意思的是，这些变化具有重复性。
在拥有多个不同突变的13个hcASD蛋白中，45%的异常相互作用可以在两个或更多突变中重复观察到。研究还发现15个互作蛋白会被不同ASD风险基因的突变以相似方式影响。
AlphaFold结构定位又提供了一层解释：研究人员找到34个突变，分布于22个hcASD基因，并位于216条预测蛋白相互作用的界面附近。在相互作用减弱的事件中，46%对应界面附近突变；而在相互作用增强事件中，这一比例只有18%。
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这说明至少对于部分错义突变，“致病”可能不是把一个蛋白完全关闭，而是重新配置它与其他蛋白的连接关系。 |
FOXP1只变了一个氨基酸，FOXP4却开始去了新的基因组位置
FOXP1提供了整项研究中最完整的一条机制链。
研究人员发现，FOXP1的R513C、R513H和L327P三个不同错义变异都能够削弱FOXP1与FOXP4之间的相互作用，校正后的P值分别为0.0011、0.0018和0.0141。
值得注意的是，它们并不位于同一个位置：R513位于FOXP1的DNA结合区域，而L327位于FOXP1与FOXP4形成二聚体的界面附近。不同结构位置的突变，最终却指向相似的蛋白互作结果。
随后，研究人员把FOXP1 R513H变异引入同基因背景的iPSC，并培养成人前脑类器官（forebrain organoids）。
在神经发生早期的第39天，突变类器官中PAX6阳性祖细胞减少，而BCL11B阳性的皮层V层神经元和TBR1阳性的VI层/亚板神经元增加。到了第101天，BCL11B阳性细胞反而减少，TBR1阳性细胞也呈下降趋势，不过后者经过多重比较校正后未达到统计学显著。
这一时间序列更像是神经元分化提前启动，随后祖细胞储备过早消耗，而不是简单的“神经元变多”或“神经元变少”。
94.7%降到67.4%：FOXP4并没有停下来，而是“换了目的地”
如果FOXP1与FOXP4不再稳定结合，FOXP4会发生什么？
研究人员利用CUT&Tag分析两种蛋白在基因组上的结合位置。
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在野生型类器官中，94.7%的FOXP4结合峰与FOXP1结合峰重叠，符合两者共同发挥作用的特征。 但在FOXP1 R513H突变类器官中，这个比例下降到67.4%。 |
变化还不止如此。突变类器官中的FOXP1结合位点仍有85%能在野生型中找到，但突变状态下的FOXP4结合位点只有37%与野生型FOXP4相同，并且出现了大约4700个对照中不存在的新FOXP4结合峰。
在受影响最明显的深层兴奋性神经元群中，43%的差异表达基因出现新的FOXP1结合，32%出现新的FOXP4结合；还有21%的差异表达基因表现出“FOXP1结合消失、FOXP4新结合出现”的转换。
这使故事发生了一个重要转折。
FOXP1突变的后果并不只是“FOXP1功能降低”。它还可能释放FOXP4，使FOXP4获得新的基因组结合位置，形成某种异常获得功能（gain of function）或特异性丧失（loss of specificity）。
一个基因突变，因此可以通过另一个并未发生突变的蛋白产生功能后果。
更关键的实验，是把FOXP4删掉以后发生了什么
相关性依然不能证明FOXP4就是神经发育异常的原因。
所以研究人员做了一个相当关键的实验：在FOXP1 R513H突变背景下，再引入FOXP4功能缺失。
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结果是，双突变前脑类器官中的深层神经元比例重新接近对照水平。也就是说，去除FOXP4能够抑制FOXP1突变产生的神经发育表型。 |
与此同时，多电极阵列（multielectrode array, MEA）记录显示，FOXP1 R513H类器官的平均神经放电频率高于同基因背景对照；但尖峰时间同步性、放电间隔以及多种爆发活动指标并没有同步改变，更接近基础放电水平变化，而不是整个神经网络活动模式全面失调。
研究人员又观察到，位于完全不同结构区域的FOXP1 L327P变异可以产生相似的神经发生表型；PPP2R5D E198K变异的类器官在早期也出现PAX6阳性细胞减少、BCL11B阳性细胞增加。
不同突变，开始在细胞命运变化上再次汇聚。
这项研究最重要的变化，是把“遗传异质性”重新定义成了一个网络问题
整项工作的核心可以概括为两层“分子汇聚（molecular convergence）”。
第一层发生在野生型状态：许多看似不同的ASD风险蛋白，本来就汇聚到共同的蛋白复合物和生物学过程。
第二层发生在突变状态：不同患者、不同基因甚至同一基因不同位置的突变，又可能以相似方向改变蛋白相互作用，从而影响共同的神经发育过程。
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ASD最稳定的疾病单位，究竟是某一个基因，还是某一种容易被扰动的蛋白网络状态？ |
如果后者成立，那么未来治疗靶点也未必只能是发生突变的蛋白本身。对于丢失的相互作用，可以考虑稳定蛋白复合物；对于异常增强或新出现的相互作用，则可能尝试抑制病理性蛋白界面。
FOXP1—FOXP4的结果正提供了一个概念验证：发生遗传改变的是FOXP1，但功能干预对象未必只能是FOXP1。
但从“漂亮的机制链”走到精准治疗，中间还有几道不能跳过的门槛
这项研究的证据链很完整，但它并没有证明已经找到了ASD治疗方案。
首先，主体蛋白互作网络是在HEK293T细胞中建立的。研究人员确实通过神经祖细胞、非洲爪蟾、人脑类器官和多个脑转录组数据进行了正交验证，这显著提高了网络的可信度，但依然不能认为1881条相互作用都会以相同强度存在于人脑发育的所有时间和细胞类型中。
其次，目前已知高可信度ASD风险基因超过250个，而本研究系统分析的是其中100个；突变网络也只覆盖30个蛋白上的54个患者来源错义变异。作者自己的模拟显示，在纳入100个风险蛋白后，网络发现新的ASD相关信号仍然没有达到饱和。
第三，AlphaFold给出的直接相互作用预测仍有10%～20%的假发现率，而二元相互作用实验验证37对候选时确认了12对。结构预测是非常有价值的筛选工具，但现阶段仍需要实验验证。
最后，功能机制研究主要深入到了DCAF7-DYRK1A-KIAA0232和FOXP1-FOXP4等少数代表性节点。从几个成功案例推及整个ASD遗传架构，还需要更大规模的突变、细胞类型和发育阶段验证。
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这些局限并没有削弱研究价值，反而说明它目前最重要的意义仍然是：提供一种把“遗传变异”逐层连接到“蛋白相互作用—细胞命运—神经功能”的研究框架。 |
或许下一个问题，不再只是“哪个基因导致疾病”
基因组学已经让我们越来越擅长回答“哪里发生了变异”。
这项研究推进了一步：同一个变异，究竟改变了哪个蛋白界面？失去了哪个互作伙伴？又意外获得了什么新的连接？这些变化发生在神经发育的哪个阶段？最终是否改变了细胞命运？
对于高度遗传异质性的疾病，这种思路尤其重要。
未来，当两个患者携带完全不同的风险基因时，也许最值得比较的不只是他们的基因名称，而是他们的突变是否把同一个蛋白网络推向了类似的异常状态。
如果答案是肯定的，那么“遗传上不同、机制上相似”的患者，就可能第一次拥有共同的干预入口。
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而这可能比不断延长风险基因名单，更接近我们真正想解决的那个问题：从一个变异开始，疾病究竟是怎样发生的？ |
参考文献
