多能性标志都在，为什么命运已经不同？
研究人员首先利用非引导性脑类器官（unguided cerebral organoid）作为一个“压力测试”。
这种体系利用的是一个经典发育特征：在缺少特定外源模式化信号时，上胚层具有向神经方向分化的倾向。因此，如果一条hPSC连这种默认神经分化都无法顺利完成，就可能意味着它在正式分化之前已经存在某种内在偏差。
研究人员比较了能够稳定产生前部神经组织的5条“competent”细胞系和6条主要产生非脑组织的“noncompetent”细胞系。一个很值得注意的结果是：尽管分化能力截然不同，这些hiPSC仍然表现出预期的多能性相关基因表达。换句话说，仅看经典多能性标志，很难提前发现谁会在之后的分化中“跑偏”。
但起始细胞的转录组已经透露了答案。noncompetent细胞中，与胚胎模式形成（embryonic patterning）和后部结构发育有关的基因更活跃。它们看起来仍处于多能状态，内部却已经带上了偏后部、偏尾侧（caudal）的分子特征。
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这提出了一个值得思考的问题：我们平时检测的“多能性”，是否只能告诉我们细胞尚未退出多能状态，却没有告诉我们它已经悄悄偏向了哪个发育方向？ |
WNT很可疑，但把WNT关掉并不总能救回来
胚胎前后轴（antero-posterior axis, A-P axis）的建立与WNT信号密切相关。
研究中，noncompetent细胞的WNT3、WNT5A、WNT5B表达总体偏高，6条noncompetent细胞系中有5条还表现出MIXL1、HHEX等WNT靶基因升高。于是，一个很自然的解释是：是不是WNT信号过强，把这些细胞提前推向了后部命运？
研究人员用泛WNT抑制剂IWP2连续处理两条noncompetent细胞系8个传代。
结果出现了明显分化。
在burb1细胞系中，处理后脑类器官的SOX2阳性面积从2.75%提高到55.91%，P=0.0022，神经分化能力明显改善。
但在另一条sojd3细胞系中，同样的处理几乎没有效果：SOX2阳性面积由4.44%变为0.31%，P=0.7619。
这意味着，“当前WNT信号太强”只能解释部分现象。对另一些细胞而言，即使把信号关掉，过去形成的状态依然存在。
问题由此发生了变化：重要的也许不只是细胞现在接收什么信号，还包括细胞是否保留了过去信号留下的表观遗传记忆。
信号消失之后，细胞为什么还记得？
研究人员于是转向染色质。
ATAC-seq显示，不同细胞系的全局染色质可及性（chromatin accessibility）其实相当接近，在转录起始位点附近±5 kb区域甚至几乎没有整体差异。
但如果只观察发生差异的调控区域，情况就不同了。noncompetent细胞中，更开放的区域富集HOX、FOX和SOX等与器官发育及组织分化有关的转录因子结合基序。也就是说，改变并不是“整个基因组全部打开或关闭”，而是集中发生在一批与发育决定有关的调控位点。
然而，还有一个问题。
启动子开放程度与基因表达变化的相关性并不好。这意味着仅仅知道某段DNA“能不能被访问”，仍不足以解释这些细胞为什么提前启动后部发育程序。研究人员继续向更深一层追踪，最后把焦点放到了双价染色质。
同时带着“激活”和“抑制”标记，反而是多能性的关键
许多关键发育基因在多能干细胞中处于一种特殊状态：启动子同时携带H3K4me3和H3K27me3。
H3K4me3通常与转录活跃相关，而H3K27me3通常与转录抑制相关。这种双价状态不是简单的“打开”或“关闭”，而是使发育基因保持poised state——准备就绪、但暂不启动。
这恰恰适合多能干细胞。
它们需要保留未来进入多种命运的可能，又不能在尚未收到明确发育信号时提前启动某一套程序。
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研究发现，noncompetent细胞的问题主要出现在H3K27me3这一侧。研究人员鉴定出302个双价基因：与competent参照相比，它们在所有noncompetent细胞中都表现出H3K27me3降低。这些基因明显富集于体节发生（somitogenesis）和中胚层发育（mesoderm development）等后部发育过程。 |
重要的是，这并不是全基因组H3K27me3普遍减少。绝大多数双价启动子并未发生同样的改变。这更像是一批特定发育基因失去了原本压住它们的“刹车”，于是提前表达。
而DNA甲基化并没有表现出相应改变。研究因此把问题进一步缩小到了一个更具体的层面：决定这些细胞分化能力的关键变量，可能不是DNA甲基化，而是特定发育位点H3K27me3与H3K4me3之间的平衡。
与其继续调整分化配方，不如先把起始状态“拨回来”
如果这种异常属于表观遗传状态，那么它是否可逆？
研究人员为此开发了一套化学染色质恢复（chemical chromatin restoration, CHR）方案。它的目标不是直接要求细胞变成神经元，而是把noncompetent细胞的染色质和转录状态恢复到更接近未承诺的前部上胚层样状态（uncommitted anterior epiblast-like state）。
结果很明显。
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在脑类器官中，burb1经过CHR后，SOX2阳性面积由2.75%升至66.71%；fiaj1由0.08%升至64.14%；sojd3由4.44%升至60.72%，三条原本分化能力受损的细胞系均出现显著改善。 |
更重要的是，原本就具有良好分化能力的hehd1并没有因此得到额外“强化”：CHR前后SOX2阳性面积分别为74.63%和65.56%，差异不显著。
这提示CHR更像是在纠正异常的起始状态，而不是简单提高所有细胞的神经分化效率。
如果只是“救回脑”，还不能说明多能性恢复了
于是研究人员做了更严格的检验：把这些细胞拿去进行其他胚层的分化。
结果并不局限于神经系统。
在肾类器官中，sojd3的PAX8阳性面积从0.74%升至42.68%，P=0.0003；HNF1B从9.87%提高到47.74%，P=0.0006。
在肠道分化中，同一细胞系的SOX17阳性面积由0.09%升到3.70%，VLN1由3.98%升至26.55%；更明显的是，CDX2由0.41%升至14.21%，CDH1由6.82%升至39.74%，后二者均达到P<0.0001。
因此，CHR带来的并不是单一神经谱系的补救，而是同时改善了与外胚层（ectoderm）、中胚层（mesoderm）和内胚层（endoderm）相关的分化能力。
这个结果反过来支持了研究的核心判断：所谓“competency”，并不是更偏爱某一种命运，而是尚未被某一种区域化身份过早限制的状态。
多能性或许不仅有“时间轴”，还有一条“空间轴”
我们通常用naïve、formative和primed来描述多能性的不同阶段，本质上是一条发育时间轴。
这项研究提出，至少对于primed hPSC而言，还可能存在另一条重要坐标——胚胎前后方向的空间轴。
研究人员把这些细胞与人干细胞胚胎模型（stem cell embryo model, SEM）的转录组进行比较。CHR后在burb1、fiaj1和sojd3中共同下降的252个转录本，在人胚胎模型的后部上胚层中恰恰更加丰富；整体转录组分析也显示，noncompetent细胞更接近posterior epiblast，而CHR处理后的细胞重新靠近anterior epiblast-like状态。
于是，一个颇具启发性的模型出现了：
一条细胞可以仍然表达完整的多能性标志，却已经在“前—后”这条空间轴上发生移动。它还没有正式分化成某个胚层，却已经缩小了未来可以高效选择的命运范围。
研究人员因此提出，多能性谱系可能同时具有时间维度和空间维度。
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如果这一框架能在更多细胞系和更多分化体系中得到验证，未来评估一条hPSC时，也许不能只问一句“它还是不是多能干细胞”，还需要问： 它现在处于哪一种区域化的多能状态？ |
这项研究很有启发性，但CHR还不是一瓶通用“修复液”
研究已经证明，CHR可以在burb1、fiaj1和sojd3三条noncompetent hiPSC中恢复多谱系分化能力。sojd3在CHR后继续于含IWP2的体系中培养至少37个传代，仍然保持competent转录组、脑类器官形成能力以及多数位点的双价染色质状态。
但研究也留下了一个值得关注的信号：fiaj1在CHR后出现了新的20q11.2扩增。作者指出，20q11.2本身就是hPSC长期培养中已知的适应性变异热点，因此倾向认为这次异常是在培养过程中被选择出来，而不是CHR直接诱导。这个解释有依据，但不能等同于已经排除了CHR相关的遗传稳定性风险。
此外，CHR本身是一个多小分子、分阶段的处理体系，而且长期维持恢复后的状态仍伴随着WNT抑制。因此，目前更稳妥的结论是：这项工作证明了某些hPSC分化偏差具有可逆的表观遗传基础，但还没有证明CHR已经是适用于所有细胞系的标准化解决方案。作者自己也强调，持续效果是在维持WNT抑制的条件下观察到的。
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这项研究值得关注的，或许不是某一种小分子组合，而是它改变了我们观察“多能性”的方式。 细胞命运的偏差，可能在形态正常、经典多能性标志也正常时就已经发生。 而决定这种偏差的，也未必是永久写进DNA序列的变化。它可能隐藏在几个关键发育基因上，以H3K27me3和H3K4me3的组合保存下来，成为一种能够跨越多次细胞分裂的“发育记忆”。 对于类器官、疾病模型和再生医学来说，这带来了一个非常实际的问题： 当一次分化反复失败时，我们究竟应该继续优化后面的“分化配方”，还是先回头检查——起始细胞是否早已站在了一个不利的发育位置上？ |
参考文献
