一张转录组地图，可能还没有告诉我们全部答案
过去十余年，单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）和空间转录组（spatial transcriptomics）极大改变了人们研究复杂组织的方式。
从一张组织切片上，我们已经能够看到不同位置表达了哪些基因，进一步推断细胞类型、细胞状态乃至疾病相关的分子变化。
但RNA更接近基因调控的“输出结果”。
在它之前，还有一个重要层级：染色质在细胞核中究竟如何组织。
人类或小鼠的染色体并不是线性地摊在细胞核中。它们形成复杂的三维结构，包括活跃与相对不活跃的A/B区室（A/B compartments）、拓扑相关结构域（topologically associating domains，TADs），以及连接远距离调控元件与基因的染色质环（chromatin loops）。
这些结构会改变不同DNA区域发生物理接触的机会，因此与基因调控密切相关。
问题在于，传统Hi-C等染色质构象捕获技术（chromosome conformation capture）往往需要打散组织。细胞来自哪里、附近是什么细胞、原本位于肿瘤核心还是免疫区域，这些空间信息很容易在实验过程中丢失。
Spatial Hi-C-RNA试图解决的，就是这个矛盾：
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10微米的空间里，同时读取基因组折叠和基因表达
Spatial Hi-C-RNA的核心思路，是把确定性微流控原位条形码（deterministic microfluidic in situ barcoding）、Hi-C和RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq）组合起来。
研究人员在组织切片上交叉施加两组微流控条形码。两个方向的条形码在交叉位置形成独特组合，于是该位置产生的染色质互作信息和RNA信息都带上了空间坐标。
这样，测序完成之后，每一组分子数据都可以被重新“放回”组织中的原始位置。
在成年小鼠脑和人黑色素瘤组织中，研究采用20 μm像素，80×80的条形码阵列，对应3.2×3.2 mm²的区域；在胚胎组织中，空间分辨率进一步提高到10 μm。
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成年小鼠脑实验共获得 6275个空间像素。每个像素中位数达到 593,680对独特Hi-C reads，其中包括 136,166个大于1 kb的顺式染色质接触（cis contacts）和 42,457个反式接触（trans contacts）。 与此同时，每个空间像素中位数检测到 1458个基因和3210个唯一分子标识符（unique molecular identifiers，UMIs）。 |
换句话说，同一个空间坐标不再只是“这里表达了什么”，还多了一层信息：
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而接下来的结果显示，这一层信息并不是转录组的简单重复。
在小鼠脑中，RNA和三维基因组看到的是两个不同层次
成年小鼠脑非常适合检验这项技术，因为海马、丘脑、大脑皮层等结构具有清楚的解剖边界。
单独使用Spatial Hi-C进行聚类时，研究人员已经能够重建海马、丘脑以及大脑皮层不同区域。
但RNA提供了更细的分辨能力。
例如，基于Hi-C数据，海马CA区倾向于形成一个整体；而RNA可以进一步把它分成CA1/2与CA3。类似地，皮层L2/3层和L4层能够通过RNA区分，但仅依赖Hi-C时仍然可能聚在一起。
这不是谁优谁劣的问题。
RNA擅长反映细胞当前的转录状态，而三维基因组更突出染色质结构层面的组织方式。两者联合以后，一些单一组学无法清楚分开的组织区域被重新划分。
更重要的是，研究人员开始能够直接分析：空间上的染色质结构变化，是否与空间上的基因表达变化同步。
以500 kb基因组区域为单位进行分析后，A/B区室状态与基因活性之间总体上以正相关为主。换句话说，越倾向于活跃A区室的区域，往往伴随着更高的转录活性。
进一步下沉到不同细胞类型，研究共识别出 357个在不同细胞类型间发生变化的100 kb A/B区室区域。
在经过计算补全的单细胞Hi-C数据中，每个细胞中位数能够识别 4160个TAD。不同细胞类型之间，一部分TAD边界变化与附近基因表达变化相对应。
到更小尺度，染色质环同样呈现明显的细胞类型特异性。
例如，Rorb基因附近的染色质环主要出现在L4/5 IT神经元中，并与Rorb的表达对应；Zic1/Zic4区域则在特定神经元群中形成了与远端增强子 hs654 的相互作用，同时Zic1/Zic4也在这些区域表达。
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肿瘤里最值得注意的现象：RNA看起来相似，染色质结构却未必相同
如果说小鼠脑证明了Spatial Hi-C-RNA能够还原正常组织结构，那么黑色素瘤实验则展示了它在疾病研究中的另一种价值。
在人黑色素瘤组织中，研究获得 6199个空间像素。每个像素中位数包含 652,994对独特Hi-C reads，包括 132,974个大于1 kb的cis contacts和 57,756个trans contacts；RNA层面每个像素中位数检测到 1107个基因和1389个UMIs。
研究还分析了距离第一张切片约 100 μm 的独立重复样本，Hi-C和RNA数据均表现出较好的一致性。
真正有意思的问题出现在聚类结果中。
一些在RNA层面看起来相对均一的区域，使用Hi-C后却被进一步分开。
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这为理解肿瘤异质性（tumor heterogeneity）增加了一个新的维度。
研究人员进一步发现，肿瘤区域与免疫细胞富集区域具有不同的A/B区室模式。肿瘤相关区域还表现出更多局部染色质相互作用。
在 PAX3 和 ACSL3 等肿瘤相关位点，肿瘤区域出现增强的染色质环，同时伴随更开放的染色质可及性（chromatin accessibility）和更高的基因表达。
从数据关系上看，结构、可及性和转录并非彼此孤立。
它们可能共同构成肿瘤细胞状态的一部分。
肿瘤发生状态转换时，染色质可能比RNA更早出现变化
研究随后利用联合的Hi-C和RNA信息进行了拟时序分析（pseudotime analysis），构建出从黑色素细胞样状态向去分化肿瘤状态延伸的连续轨迹。
沿着这条推断出的轨迹，黑色素细胞相关基因 DCT 逐渐降低，而包括 PLCL1 在内的一些基因逐渐升高。
与此同时，A/B区室也发生持续变化。
尤其值得关注的是 GABRB3 和 ITGA6 等位点：在拟时序轨迹上，研究观察到区室变化出现在可检测的转录变化之前。
这个结果很容易让人产生一个诱人的猜测：三维基因组改变，会不会是后续转录改变的“前奏”？
但这里必须保持谨慎。
| 拟时序描述的是数据推断出的状态顺序，而不是直接的时间追踪实验，更不能单凭这一结果证明三维基因组变化导致了后续基因表达改变。 |
它更像是在提出一个可以进一步实验验证的机制假设。
研究还发现，拷贝数变异（copy-number variation，CNV）可以很好地区分肿瘤与非肿瘤区域，例如肿瘤区域存在 CDKN2A/CDKN2B 抑癌基因区域的局部缺失。
但是，仅靠CNV并不能解释肿瘤内部更细的空间异质性。
换句话说，两个区域都可能已经是肿瘤，但它们仍然可以拥有不同的三维基因组状态。
在更精细的TAD层面，与免疫细胞富集区域相比，肿瘤区域出现了 193个丢失的TAD边界和187个新增的TAD边界。
这提示肿瘤演化不仅涉及DNA序列和拷贝数的变化，也伴随着染色体内部“分区方式”的重塑。
胚胎神经发生过程中，基因组也在持续“重新组织”
Spatial Hi-C-RNA的第三个应用场景，是胚胎发育。
研究人员首先分析了胚胎第11.5天（embryonic day 11.5，E11.5）的小鼠完整切片，并将空间分辨率提高到 10 μm。
这一实验一次获得了 32,799个空间像素。每个像素中位数包含 125,582对独特Hi-C reads，RNA层面中位数检测到 453个基因和869个UMIs。
到E13.5阶段，研究又获得 19,278个空间像素，每个像素中位数包含 98,198对独特Hi-C reads，并检测到 734个基因和1076个UMIs。
将细胞状态沿神经发生过程排列后，可以看到清楚的发育梯度：早期更多是放射状胶质细胞（radial glia）和神经祖细胞，随后逐渐转向未成熟神经元，再到分化后的兴奋性和抑制性神经元。
而三维基因组并没有保持静止。
在腹侧后脑区域，短距离相对于长距离的染色质接触比例随着神经分化逐步增加；部分染色体19区域逐渐转向更活跃的A区室，并伴随 Sorcs3、Sorcs1 等神经相关基因表达增强。
在更精细的5 kb尺度上，分化神经元相关基因 Dscaml1 周围的染色质环逐渐增强，而祖细胞标记 Racgap1 的相互作用则更多出现在祖细胞状态。
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一个叫Grin2b的基因，让这种变化变得尤其直观
研究人员进一步比较E11.5和E13.5两个发育阶段。
总体来看，一部分A/B区室模式在两个阶段之间保持稳定，它们更多与放射状胶质细胞、祖细胞和干性相关程序有关。
另一部分区室变化则具有明显的发育阶段特异性，并富集于兴奋性神经元和成熟神经元相关基因。
其中一个很有代表性的例子是 Grin2b。
随着细胞从放射状胶质细胞进入未成熟神经元，再进一步成为分化神经元，Grin2b周围原本较大的染色质结构域逐渐减弱，并分解为更小的亚结构域。
研究人员将这种现象称为结构域“融化”（domain melting）。
与此同时，Grin2b在成熟神经元中的表达逐渐升高。
值得注意的是，研究并没有停留在两个时间点的简单比较。研究人员进一步把Spatial Hi-C-RNA与高分辨率空间转录组Stereo-seq整合，并利用最优传输（optimal transport）方法，把E11.5的空间状态映射到E13.5。
结果显示，早期胚胎中的部分染色质状态，与后续发育阶段的细胞和空间状态之间存在可识别的对应关系。
这提出了一个很值得继续关注的问题：
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目前这仍然是需要更多实验验证的问题，但它可能是这项研究最值得延伸的方向之一。
Spatial Hi-C-RNA改变的，可能是我们观察组织的“维度”
空间转录组解决了一个重要问题：哪些基因，在什么位置表达？
Spatial Hi-C-RNA又增加了一个问题：
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这两类信息并不完全重合。
在小鼠脑中，RNA能够识别更细的转录亚区，而Hi-C提供了另一层结构分类；在黑色素瘤中，RNA看起来相似的区域可能拥有不同的染色质组织；在胚胎神经发生过程中，基因表达的改变则与A/B区室、TAD以及染色质环的持续重塑相伴发生。
因此，与其把三维基因组理解成RNA表达的附属信息，不如把它看作细胞状态的另一个坐标轴。
但这项技术距离“完整读取一个细胞的空间调控体系”仍然有明显距离。
目前10 μm像素在胚胎组织中通常仍包含约 1–2个细胞，20 μm像素在成年小鼠脑中可能包含 1–3个细胞，因此所谓“近单细胞分辨率”并不等同于严格意义上的单细胞，更不是亚细胞分辨率。
RNA捕获依赖poly(A)，因此无法覆盖许多非polyadenylated RNA，包括部分长链非编码RNA（long non-coding RNA）和组蛋白RNA；Hi-C部分依赖限制性内切酶，也会引入序列相关的片段化偏倚。
此外，为了保存组织空间结构，原位反应不可避免地牺牲了一部分分子捕获效率。与HiRES等单核方法相比，Spatial Hi-C-RNA的单像素灵敏度仍然更低。
这些限制反而帮助我们更准确地理解这项工作的定位：
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未来，如果这一框架能够进一步与染色质可及性、DNA甲基化、蛋白质、病理图像乃至纵向疾病样本结合，我们或许会逐渐发现：很多看似突然发生的细胞状态变化，在RNA出现明显变化以前，已经在染色质的空间组织中留下了痕迹。
届时，我们研究的就不再只是“哪些基因发生了变化”。
而是更进一步：
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参考文献
