Nature Methods | 空间组学进入“功能状态”时代？REDCAT直接解析单细胞代谢异质性

一张组织切片里，我们知道细胞“是谁”，却未必知道它正在“做什么”

近几年，空间转录组学（spatial transcriptomics）、空间蛋白组学（spatial proteomics）快速发展。我们可以在组织原位看到不同细胞表达哪些RNA和蛋白，也可以据此推断糖酵解、脂肪酸代谢、氧化磷酸化等通路是否活跃。

问题在于：基因表达并不等于代谢活动本身。

某个糖酵解相关基因表达升高，并不能保证葡萄糖代谢通量（metabolic flux）一定同步增加。代谢受底物供应、酶活性、细胞器状态、氧分压以及周围细胞影响，其变化速度也可能远快于转录水平。

质谱成像（mass spectrometry imaging，MSI）能够更加直接地观察代谢分子，但许多方法具有破坏性，并且经常需要在分子覆盖度与空间分辨率之间取舍。如果想继续回答“这些代谢信号究竟来自B细胞、T细胞还是巨噬细胞”，问题又变得复杂。

REDCAT的思路，是把几种互补的光学方法放到同一张切片上。

首先利用受激拉曼散射显微成像（stimulated Raman scattering microscopy，SRS）观察蛋白和脂质；利用双光子激发荧光（two-photon excited fluorescence，TPEF）测量NADH和FAD的自发荧光，计算NADH/FAD光学氧化还原比值（optical redox ratio）；再利用二次谐波产生（second harmonic generation，SHG）观察胶原结构。

完成这些无标记或低干预成像后，同一张组织切片继续进行高通量CODEX免疫荧光（CODEX immunofluorescence），用数十种蛋白标志物确定细胞身份。

最后再通过 MaxFuse 等计算方法，把代谢图像和细胞类型逐细胞对应起来。研究中的高光谱SRS（hyperspectral SRS）覆盖约2,700–3,150 cm⁻¹的波数范围，包括51个光谱通道，光谱分辨率约10 cm⁻¹；CODEX则可以同时分析约50种蛋白标志物。

于是，一个细胞不再只有“CD20阳性B细胞”这样的身份标签，它还同时拥有自己的脂质、蛋白、脂质不饱和程度和氧化还原状态。

研究人员首先观察正常人淋巴结。

他们分析了一块来自健康供者的福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）淋巴结组织，在约 1.6 mm × 1.6 mm 的区域中进行成像，并使用 48种蛋白标志物进行细胞分型。蛋白表达的无监督聚类最终识别出9个空间分布不同的细胞群。

结果中一个很有启发性的现象出现在生发中心（germinal center）。

生发中心中的B细胞并不是均一的。暗区（dark zone）中的B细胞正在快速增殖和进行体细胞高频突变（somatic hypermutation）；进入明区（light zone）以后，B细胞则更多参与抗原呈递、选择以及与滤泡辅助性T细胞（T follicular helper cell，TFH）的相互作用。

REDCAT观察到：明区B细胞整体具有更高的NADH/FAD比值，同时具有更高的不饱和脂质/饱和脂质比值；暗区B细胞的这两个指标则相对较低。

换句话说，尽管它们都属于生发中心B细胞，仅仅因为所处空间位置和功能阶段不同，就已经呈现不同的氧化还原状态和脂质代谢特征。研究人员据此认为，明区B细胞更偏向还原状态以及合成代谢相关的脂质重塑，而高速增殖的暗区B细胞则呈现更加氧化的状态。

更值得注意的是，当研究人员把不同细胞的脂质/蛋白比值、NADH/FAD比值以及不饱和/饱和脂质比值投射到细胞类型中时，同一种细胞内部依然存在很宽的代谢状态分布。

这意味着一个容易被忽略的问题：

一个B细胞是什么，与它此时正在经历什么，是两个不同层面的问题。激活、分化、邻近细胞以及空间位置，都可能改变代谢。

这也是空间代谢研究真正值得关注，更准确地说，值得进一步关注的地方：它让细胞身份从一个静态标签，开始与动态功能状态发生联系。

接下来，研究人员遇到了一份非常特殊的淋巴瘤样本。

同一块活检组织中，同时存在低度恶性的慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）区域，以及侵袭性更强的弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）区域。

这种从CLL向DLBCL转化的现象称为 Richter转化（Richter transformation）。

也就是说，在同一块约 1.8 mm × 2.0 mm 的组织中，研究人员获得了一个罕见的机会：可以沿着空间位置观察肿瘤由相对惰性状态向侵袭性状态变化时，细胞代谢发生了什么。

在这份样本中，研究人员利用 35种蛋白标志物进行CODEX分析，识别出12个细胞群。进一步整合蛋白和代谢信息后，又识别出3种具有不同代谢特征的肿瘤细胞状态。

其中一个细胞群主要对应CLL，另一个主要对应DLBCL。

而位于两者之间的第三类细胞，表现出介于二者之间的代谢特征。

高光谱SRS进一步发现，这些空间上位于CLL和DLBCL之间的CD20阳性B细胞，在 2,850 cm⁻¹和2,880 cm⁻¹ 等脂质相关拉曼峰上，都呈现出不同于两端肿瘤细胞的光谱。

因此，作者提出了一个很有吸引力、但仍需要谨慎验证的解释：

这里的“可能”非常重要。

这项研究并没有进行细胞谱系追踪（lineage tracing），所以无法仅凭空间上的连续性和代谢特征证明这些细胞必然是肿瘤演进的先后阶段。但如果这个现象能够在更大规模样本中重复，它意味着肿瘤恶性转化可能不仅表现为突变和转录状态改变，还伴随着可被直接成像的代谢状态迁移。

更有意思的是，代谢异常没有停留在恶性B细胞内部。

研究人员分析了CLL、过渡区域和DLBCL附近的多种T细胞，包括辅助性T细胞（helper T cell）、细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell）、记忆T细胞（memory T cell）以及耗竭T细胞（exhausted T cell）。

结果发现，靠近CLL细胞的多个T细胞亚群都出现明显的脂质积累。

这让“肿瘤代谢重编程（metabolic reprogramming）”这个概念发生了一点变化。

过去讨论癌细胞代谢时，我们很容易把注意力全部放在癌细胞自身：它怎样利用葡萄糖，怎样改变脂质合成，怎样适应缺氧。

但在真实组织中，肿瘤并不是孤立存在的。

如果邻近T细胞、巨噬细胞、内皮细胞也发生代谢变化，那么所谓的“肿瘤代谢”可能实际上是一种组织尺度的代谢生态改变。

该研究中的数据还显示，正常淋巴结里具有一定规律的代谢状态与空间组织关系，在淋巴瘤中明显被打乱：正常组织具有较清晰的免疫细胞空间分区，而肿瘤组织中的细胞邻域更加混杂；淋巴瘤整体还表现出更高的总脂质、不饱和脂质和NADH/FAD比值。

肿瘤改变的，也许不仅是哪一种细胞变多了，而是细胞之间原本有序的空间和代谢关系被重新组织了。

REDCAT进一步把分辨率推进到亚细胞尺度。

研究人员发现，CLL细胞倾向于形成较大的脂滴（lipid droplet，LD）聚集，而DLBCL细胞中的脂滴更小，脂质在胞质中的分布也更加弥散。

甚至在DLBCL细胞的核仁和核周区域，也可以检测到增强的脂质信号。

随后，他们直接分析单个细胞核的SRS光谱。

结果出现了本文最直观的一组数字：

这相当于把“肿瘤异质性（tumor heterogeneity）”推进到了细胞核的化学组成层面。

但这里仍然不能跳得太快。

核仁中的脂质为什么增加？它是否影响染色质状态、基因表达或者核结构稳定性？它是肿瘤转化的驱动因素，还是快速生长产生的伴随现象？

目前都没有答案。

研究人员也明确把核内脂质与基因调控之间的关系视为需要进一步研究的问题，而不是已经建立的机制。

为了判断这种方法能否用于另一类组织以及新鲜冰冻样本（fresh-frozen tissue），研究人员又分析了正常人肝组织。

肝小叶本身就是研究空间代谢的天然模型。

从门静脉区域到中央静脉区域，肝细胞长期处于不同的氧、营养物质和信号环境中，由此形成经典的肝脏分区（liver zonation）。

研究人员在约 1.6 mm × 1.6 mm 的区域中进行了TPEF-SRS成像和 47重CODEX 分析，识别出13个细胞群，并利用ASS1、CYP3A4和GLUL等标志物区分Zone 1、Zone 2和Zone 3。

结果显示，脂滴并没有均匀分布。

靠近门静脉的Zone 1脂滴水平和NADH/FAD比值较低，而脂滴面积主要集中于Zone 2。

更有意思的是，含脂滴的细胞并不只是肝细胞。

研究中相应细胞组成中，肝细胞占 37.1%，CD141阳性细胞占 35.7%，CD45阳性细胞占 14.9%，CD68阳性细胞占 6.5%，其余细胞约占 5.8%。

甚至同样属于肝细胞，不同空间区域的SRS光谱也并不相同。

研究人员进一步以中央静脉为中心，每约100 μm划分空间区域，对细胞核进行分析。结果显示，2,883 cm⁻¹/2,960 cm⁻¹的光谱强度比值随着距离中央静脉增加而升高，而类似趋势在门静脉附近并没有出现。

也就是说，细胞核本身的化学状态都带有空间位置信息。

这再一次提醒我们：在组织中，同一种细胞并不是同一种生物学状态。

如果只把这项研究理解为一种分辨率更高的成像技术，可能会低估它的价值。

它解决的一个核心问题是：

传统空间转录组告诉我们“这个地方可能启动了什么程序”；免疫荧光告诉我们“这里是什么细胞”；代谢组告诉我们“这里有什么分子”。

REDCAT尝试把这些问题变成：

这个位置的这个细胞，此刻表现出怎样的化学和代谢状态？

而且它能够兼容FFPE组织，这一点尤其值得关注。

病理科保存了大量石蜡组织。如果未来能够在这些历史样本上稳定地恢复细胞类型与代谢信息，就有可能把大量已有临床随访资料与空间代谢表型重新连接起来。该研究也提出，FFPE组织中的脂质结构仍可保留到足以进行这类分析的程度。

这可能为肿瘤分型、疾病进展研究以及治疗反应研究提供新的分析维度。

但关键词仍然是：可能。

这项研究的方法学展示很强，但其局限性也在。

首先，该研究的关键生物学展示集中在一份健康淋巴结组织、一份包含CLL和DLBCL区域的Richter转化活检，以及正常肝组织切片。部分分析使用了3个不同感兴趣区域（region of interest，ROI）进行统计，但3个ROI并不等于3位独立受试者。例如胶原纤维比较和部分肝脏定量均明确使用了n=3个ROI。

因此，这项工作首先证明的是技术能力和生物学发现潜力，而不是某种代谢特征已经成为可泛化的疾病生物标志物（biomarker）。

其次，NADH/FAD是氧化还原状态的光学代理指标（proxy），较高比值与更还原的状态、糖酵解增加或氧化磷酸化受限相一致，但它不能直接等同于某一条代谢通路的真实通量。

第三，研究人员也明确指出，REDCAT目前仍面临代谢物注释（metabolite annotation）和分子覆盖度（molecular coverage）不足的问题。未来还需要扩展指纹区光谱、建立更完善的代谢物参考库，并结合其他空间组学技术。

这些限制并不会削弱方法本身的价值，反而指出了下一步最值得解决的问题。

过去几年，单细胞和空间组学不断增加测量维度：RNA、蛋白、染色质、突变、代谢物……

但这篇研究带来的一个更深层提示是：维度越多，并不意味着只需要把更多数据叠加在一起。关键在于能否在正确的空间尺度上，把不同层面的生物学状态对应到同一个细胞。

REDCAT在正常淋巴结中看到，同样的B细胞因为位于生发中心明区或暗区而具有不同代谢状态；在Richter转化组织中看到，从CLL到DLBCL之间可能存在连续变化的代谢状态；在正常肝脏中看到，即使是同一类肝细胞，其代谢和核内化学特征也随着空间位置发生变化。

这些结果共同指向一个问题：

也许更完整的描述应该包括：

它是什么细胞，它在哪里，它周围是谁，它正在使用什么样的代谢程序，以及这种状态接下来可能走向哪里。

如果未来这些空间代谢特征能够在更多独立患者、更大队列和治疗前后样本中得到验证，那么病理切片所提供的信息，可能不再只是形态和分子标志物。

它还可能成为一张记录细胞功能状态的地图。

而到那时，一个值得继续关注的问题是：

这或许才是REDCAT这类技术留下的最有价值的问题。