Nature Genetics | 增强子也能“按需设计”了：深度学习从零生成调控DNA，并在小鼠胚胎中验证成功

增强子（enhancer）是基因组中的顺式调控元件（cis-regulatory element）。它本身并不编码蛋白，却可以决定一个基因在什么组织、什么细胞、什么发育阶段以及多大程度上被表达。

过去几十年，我们已经可以通过ATAC-seq、ChIP-seq等技术，在基因组中寻找可能具有增强子功能的区域。近年来，深度学习进一步推动了一个方向：直接从DNA序列预测染色质开放程度、转录因子结合以及增强子活性。

但“预测自然界已有的序列”和“设计一条自然界原本不存在的功能序列”，是两个层次的问题。

对于哺乳动物来说，这尤其困难。组织中的基因调控受到转录因子（transcription factor，TF）、染色质状态、发育阶段和基因组环境等多重因素影响。一个模型即使能够区分开放与关闭的染色质区域，也不意味着它能够知道“什么样的序列会在心脏中成为功能性增强子”。

这正是这项研究试图解决的问题。

第一步：先让模型学会，哪些DNA有可能被“打开”

研究人员选择了胚胎发育第11.5天（E11.5）的小鼠，分别研究心脏、四肢和中脑。

第一阶段，他们利用ATAC-seq获得的染色质可及性（chromatin accessibility）信息训练卷积神经网络（convolutional neural network，CNN）。

模型的输入非常直接：一段1,001 bp的DNA序列。

输出则是：这段序列在特定组织中的染色质开放程度。

这里有一个非常重要的实验设计：为了判断模型是不是简单“记住”训练集，研究人员把小鼠18号染色体整体排除在训练之外，作为固定测试区域。

即使面对这些从未参与训练的基因组区域，模型对染色质可及性的预测仍然表现良好。在18号染色体上，预测值与真实ATAC-seq信号的Pearson相关系数达到至少 0.76；在经过平衡的全基因组测试序列中，相关系数达到至少 0.88。

更关键的是，模型不只是知道“哪里开放”，还能够一定程度上识别组织之间开放程度的差异。在组织特异性区域上，不同组织之间预测差异与真实差异的相关系数达到至少 0.62。

换句话说，一段DNA是否容易形成开放染色质，其中相当一部分信息确实存在于DNA序列本身。

但这里还有一个问题。

从“能打开”到“能调控”，中间还差关键的一步

一个区域可以是开放的，却不一定具有增强子活性。

因此研究人员进行了第二阶段训练：把已经学会“DNA序列→染色质开放程度”的模型，再用经过体内实验验证的增强子进行迁移学习。

这些功能标签来自VISTA Enhancer Browser。

问题在于，与大规模ATAC-seq数据相比，真正经过小鼠胚胎体内验证的增强子并不多：每种目标组织可用于训练和评估的已验证组织特异性增强子只有大约 311—432条。

在机器学习研究中，这属于相当有限的监督数据。

但研究人员没有从头训练一个新的模型，而是让模型先利用大量ATAC-seq数据学习通用的DNA调控特征，再利用少量功能增强子完成“微调”。

结果相当明显。

经过迁移学习后，模型在未参与训练的增强子序列上，阳性预测值（positive predictive value，PPV）分别可以达到大约上述水平。

也就是说，当模型以较严格标准挑出一个它认为可能有活性的增强子时，超过七成的候选序列在已有实验数据中确实表现为阳性。

更有意思的是，如果取消这种“两阶段学习”，效果明显下降。

单纯依赖染色质可及性模型，或者直接用有限的VISTA增强子从头训练模型，在不同组织中的PPV会下降 20.9%—52.1%。

这说明模型首先从规模较大的染色质数据中学习“调控序列的基本规律”，随后再利用较少的功能标签学习“什么才是具有体内增强子活性的序列”，可能比直接用小数据集硬训一个模型更加有效。

模型会不会只是“背答案”？30万条随机DNA提供了一次压力测试

深度学习处理基因组序列时，一个始终需要警惕的问题是：

研究人员为此加入了两组规模很大的负对照：

30万条随机生成的DNA序列，以及30万条来自基因组中染色质关闭区域的序列。

经过迁移学习的模型能够有效排除这两类序列。

当然，其中也有少量随机序列获得了非零预测分数。值得注意的是，这些序列中往往偶然包含了组织特异性转录因子的结合基序（motif）。

这其实揭示了一个很有意思的事实：随机DNA并不意味着绝对“没有调控潜力”。如果随机组合恰好形成了合适的转录因子结合模式，它仍有可能部分满足调控序列的要求。

因此，一个增强子并不一定需要复制自然基因组中的某段序列。

接下来，研究人员不再预测DNA，而是让模型开始设计DNA

真正关键的实验从这里开始。

研究人员首先为每种组织生成 1,200条随机DNA序列，然后使用Ledidi这一基于梯度优化的序列设计方法，不断修改DNA，使它同时满足两个条件：

在目标组织中具有较高的预测染色质可及性，同时具有较高的预测增强子活性。

并且，他们还要求这些序列尽可能不在另外两种组织中活跃。

经过优化并排除与小鼠或人类基因组存在显著序列相似性的候选序列后，最终得到可继续分析的设计序列约为：

进一步按照“目标组织高活性、非目标组织低活性”的严格标准筛选后，分别留下 654、351和787条高置信候选序列。

最后，研究人员只从中选择了15条。

每个组织5条。

这些序列长度均为 1,001 bp，而且与小鼠基因组、人类基因组以及VISTA已知增强子均没有显著序列匹配。

因此，这并不是把某个天然增强子稍作修改后重新测试，而是在相当大的序列空间中设计出的新序列。

接下来，问题就变得非常简单：

15条设计序列进入小鼠胚胎，15条都在目标组织中产生了信号

研究人员把这些合成增强子连接到报告基因系统中，并利用定点转基因方法将其导入小鼠胚胎，在E11.5阶段检测报告基因表达。

实验采用了与VISTA增强子数据库类似的判定标准：只有当至少3个独立胚胎在目标组织中出现可检测的报告信号，才将该增强子判为阳性。

最终：

也就是 15/15。

这是这项研究中最容易被记住的数字。

但如果只停留在“15/15”，反而容易忽略一个更值得讨论的问题：

“能在目标组织中工作”和“只在目标组织中工作”，并不是一回事。

15/15很漂亮，但组织特异性并没有达到100%

在5条为心脏设计的增强子中，4条只在心脏中表现出明显活性；另外1条除了心脏外，在脑中也出现了一些较弱的非目标活性。

在5条中枢神经系统增强子中，同样有4条表现出较好的CNS特异性，另1条在心脏出现弱信号。

四肢增强子的情况更加有意思。

5条序列都在四肢中表现出很强的活性，但与此同时，它们还会在颅面和躯干间充质等其他组织中出现较弱活性。

这并不完全是“设计失败”。

这些组织存在共同的转录调控背景，其中包括TWIST1等转录因子的表达。模型要求的是“四肢高活性”，但生物系统中的组织边界，并不一定对应完全独立的调控程序。

这也是理解这项研究时必须保留的一层谨慎：

对于未来基因治疗而言，这一区别尤其重要。

模型还学到了一个更深层的问题：DNA调控不是几个motif简单相加

如果模型只是判断“有没有MEF2”“有没有TWIST1”，其实并不算特别令人意外。

但研究人员进一步分析模型内部学到的序列特征后发现，迁移学习改变了不同转录因子基序的重要性。

例如：

在心脏模型中，MEF2相关基序具有较高贡献；

在四肢模型中，TWIST1更加重要；

在中枢神经系统模型中，SOX3等神经发育相关调控因子的基序获得较高权重。

相反，像CTCF这样广泛存在、主要参与染色质结构和绝缘子功能的因子，在从“染色质可及性”模型转向“增强子活性”模型后，其重要性下降。

这意味着模型开始区分：

什么特征只是与“染色质开放”相关，什么特征更接近“组织特异性增强子功能”。

更进一步，模型还学到了motif之间的协作关系、两个motif之间的距离偏好，以及motif周围碱基对功能的影响。

也就是说，DNA调控可能并不是简单的：

同样的两个motif，排列方向不同、距离不同、周围几个碱基不同，其功能都可能发生改变。

这通常被称为调控语法（regulatory grammar）。

从这个角度看，深度学习在这里的价值并不只是“预测得更准”，而是帮助研究人员探索一个此前很难系统解析的问题：

一段能够工作的增强子，其序列规则究竟有多复杂？

如果一个组织根本没有几百条实验验证增强子，还能不能设计？

这是这项技术是否具有可扩展性的关键。

现实中，大多数细胞类型和组织并没有VISTA这样规模的体内验证增强子数据。

于是研究人员又做了一组实验：不用真正实验验证过的增强子作为迁移学习标签，而是根据现有基因组数据“推断”哪些区域更可能是增强子。

例如，将以下信息组合起来：

染色质开放、H3K27ac、H3K4me1、远离转录起始位点、缺少CTCF结合，或者只在某个目标组织中开放。

结果显示，这些“推断标签”虽然不如直接使用VISTA实验数据，但明显优于只预测染色质开放程度。

尤其是利用组织特异性ATAC-seq峰建立标签时，效果较好。

研究人员估计，在心脏、四肢和CNS中，这类模型理论上能够支持至少约60%的合成增强子设计成功率。

这个结果的意义在于：未来可能不必等待某一种罕见细胞类型积累数百条体内验证增强子，才开始进行序列设计。

大量已经存在的bulk ATAC-seq和single-nucleus ATAC-seq数据，本身可能就可以成为设计起点。

当目标从“整个脑”缩小到“前脑”，事情马上变难了

研究人员随后提出了一个更苛刻的问题：

能不能不只是设计“在CNS工作的增强子”，而是设计只针对某个脑区的增强子？

他们分别设计了两条前脑（forebrain）增强子和两条中脑（midbrain）增强子。

前脑设计取得了一定成功。两条前脑增强子都在前脑中表现出活性，其中两个构建体分别在 7/8和4/4 的胚胎中观察到了预期信号。但其中一条同时在四肢产生了明显的非目标活性。

中脑设计则遇到了更明显的问题。

两条候选序列中，一条完全没有活性；另一条在8个胚胎中只有2个观察到零星中脑信号，而且由于报告载体中出现了 419 bp重复片段，这一结果最终无法进行可靠解释。

这里反而暴露出了这项技术当前非常重要的边界：

越往细胞类型、亚群甚至状态特异性方向推进，对训练数据和模型分辨率的要求都会迅速提高。

从“读懂DNA”到“设计DNA”，基因组学正在发生一次方法论变化

过去相当长时间里，基因组学最重要的任务是“读”。

测序技术告诉我们DNA是什么，功能基因组学告诉我们哪些区域可能发挥作用，机器学习则试图预测某个变异会造成什么影响。

现在，一个新的方向正在逐渐形成：

如果这种能力未来扩展到更多组织、细胞类型和疾病状态，它可能直接影响功能基因组学（functional genomics）、合成生物学（synthetic biology）和基因治疗（gene therapy）。

例如，在基因治疗中，一个长期存在的问题是如何让治疗基因只在目标细胞中表达。

如果增强子能够按照目标组织进行计算设计，那么理论上就可能把“哪里表达”这一问题本身变成一个可优化的工程参数。

但这里必须强调“理论上”。

这项研究验证的是小鼠E11.5胚胎、特定报告基因和标准化启动子环境中的单个增强子，并不是临床基因治疗系统。

天然基因组中的增强子还会受到启动子类型、染色质环境、三维基因组结构以及多个调控元件协同作用的影响。一个增强子在标准报告系统中表现良好，并不意味着把它放到任意天然基因座中都能产生相同效果。

研究人员也明确指出，目前的方法集中于单个增强子，并没有解决长距离、多增强子共同组成的调控架构，也没有系统解决增强子强度、任意序列长度、多组织复合表达以及动态发育状态等问题。

因此，这项工作的意义并不是“基因表达已经可以任意编程”。

更准确的说法是：

这已经跨过了非常关键的一步。

最值得继续关注的，也许不是“AI能不能设计DNA”

15/15当然足够吸引眼球。

但从更长的时间尺度看，比这个数字更重要的问题可能是：

当模型能够从大量天然DNA中提取调控规律之后，它最终会不会设计出一些自然进化从未产生，却比天然序列更符合我们目标的调控元件？

天然增强子并不是为了实验便利、基因治疗或人工系统而进化出来的。它们是在发育、生殖、生存和进化约束下形成的结果。

而计算设计的目标函数可以完全不同。

我们可以要求一个增强子更短、更强、更弱、更特异，甚至要求它同时满足多个约束条件。

这意味着，未来的一个重要问题可能不再只是：

“基因组中的增强子是怎样工作的？”

而会进一步变成：

“所有可能的DNA序列中，哪些调控方案是生物学允许的，而自然界只是尚未使用？”

当研究开始从解释天然序列走向探索“可能序列空间”，基因组学研究的对象也在悄然扩大。

我们研究的不再只是已经存在的DNA。