RNA-seq已经成为生命科学研究中最重要的技术之一。
它可以告诉我们哪些基因被表达、哪些通路被激活，也可以比较药物处理前后、疾病与正常组织之间乃至不同细胞类型之间的转录状态。
但传统RNA-seq具有一个非常明确的特点：
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它通常是一种破坏性检测（destructive measurement）。 |
提取RNA意味着裂解细胞。因此，如果要观察第1天、第2天、第3天和第4天的变化，通常需要提前准备多组样本，在每个时间点“牺牲”一组。
这带来一个容易被忽略的问题。
假设培养皿A和培养皿B即使接受完全相同的处理，由于初始细胞状态、培养微环境和随机生物学波动不同，它们也不可能完全一样。那么，用A代表第1天、B代表第2天、C代表第3天，获得的时间变化中，就同时混入了样本间差异。
单细胞转录组中的伪时间分析（pseudotime analysis）可以从大量细胞的静态状态推断发育轨迹，但“根据不同细胞推断时间”与“连续观察同一批细胞”仍然不是一回事。
Najia等人的研究，实际上改变了分析方向。
他们不再关注：
“怎样反复从活细胞里面取RNA？”
而是换了一个问题：
“能不能让细胞自己把RNA送出来？”
研究人员选择了Moloney鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus, MMLV）的结构蛋白Gag。
Gag具有一个重要能力：能够在细胞膜附近聚集，形成膜包裹的病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）。这些颗粒缺少完整病毒复制系统，因此并不是能够自主复制的病毒。
更重要的是，Gag本身能够与RNA相互作用。
研究人员于是设想：如果让细胞表达Gag，是否可以让Gag在形成VLP时顺便包装一部分细胞RNA，再将这些RNA随着VLP释放到培养液？
实验结果首先证明，这条路径是可行的。
研究人员在HEK293T细胞中表达MMLV Gag，在培养液中观察到直径约160 nm的VLP。作为对照，他们删除Gag的基质结构域（matrix domain, MA），得到GagΔMA；由于这一结构域对于膜定位和颗粒形成非常重要，GagΔMA组明显失去了正常VLP形成能力。
更关键的是，培养液中的RNA并不是简单来自细胞破裂。
例如，Gag表达细胞释放到培养液中的GAPDH转录本能够抵抗RNase处理，说明RNA受到了颗粒结构的保护；这些RNA在37℃放置4天后仍然可以检测到。
也就是说，细胞确实可以把RNA“装进”VLP，再释放到细胞外。
接下来才是决定这项技术价值的关键问题：这些RNA能够代表细胞内部的转录状态吗？
研究人员对HEK293T细胞进行了RNA-seq。
传统细胞裂解物平均能够检测到12,931个基因。
其中，竟有11,598个基因同时能够从Gag产生的VLP培养液中检测到。
换句话说，这并不是只能检测几个高表达标志物的传感系统，而已经进入了转录组尺度（transcriptome-wide）。
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培养液与细胞裂解物中的基因表达量比较：Pearson r = 0.797 |
这当然还远没有达到“培养液RNA等同于完整细胞转录组”的程度，但已经足以说明：VLP携带的信息具有相当强的转录状态代表性。
而且，这种能力并不仅存在于短暂转染的HEK293T细胞。
在稳定表达Gag的HEK293T细胞中，培养液与细胞裂解物转录组仍然达到r=0.714；研究人员还在HT1080细胞、诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）、原代内皮细胞以及原代基质成纤维细胞中进行了验证。
利用CellNet分析培养液中的RNA，甚至可以重新判断这些RNA来自什么类型的细胞。
这意味着，细胞释放到培养液中的VLP，并非只携带零散RNA，而保留了相当程度的细胞身份信息。
如果只看到相关系数接近0.8，很容易产生一个过于乐观的理解：
既然培养液RNA和细胞RNA高度相关，那么以后是不是可以直接用培养液代替细胞RNA-seq？
这项研究恰恰提示我们不要这么理解。
VLP包装RNA存在明显偏好。
最突出的现象之一，是线粒体RNA明显减少。
这并不难解释。Gag主要在细胞质和细胞膜附近组装，而线粒体转录本主要位于线粒体内部，因此被包装进入VLP的机会较低。
研究人员进一步利用梯度提升模型（gradient boosting model）和SHAP分析发现，影响RNA是否进入VLP的重要因素之一，正是RNA在细胞质和细胞核之间的分布。越偏向细胞质的RNA，越容易在VLP样本中富集。
RNA长度、非翻译区（untranslated region, UTR）的GC含量以及某些序列特征，也与包装效率有关。
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更准确的理解是：这项技术获得的是经过VLP包装机制“过滤”之后、偏向细胞质的转录信息。 |
这个区别非常重要。新技术的价值并不一定来自“完美复制传统RNA-seq”，而可能来自它提供了传统技术难以获得的另一个维度——时间连续性。
研究人员随后让表达Gag的iPSC向神经元方向分化。
通过诱导neurogenin-1和neurogenin-2表达，这些细胞在4天内逐渐形成具有双极样形态的神经元。
传统方案需要在不同时间点分别裂解不同的细胞样本。
而采用细胞自我报告后，研究人员只需要每天收集培养液中的VLP，再让原来的细胞继续生长。
从第0天到第4天，细胞裂解物和培养液RNA都记录到了清晰的转录状态变化。
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第0天与第4天比较，有772个差异表达基因（DEGs）同时被两种方法识别。 两种方法对这些共同差异基因变化幅度的相关性达到r=0.90。 |
更重要的是，生物学过程也完全符合神经分化的预期。
随着分化进行，DNMT3B、LIN28A、NANOG和PRDM14等多能干细胞相关基因逐渐降低；与此同时，MAP2、RBFOX3和TUBB3等神经元相关基因不断升高。
基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）进一步显示，与干细胞分裂和增殖相关的程序持续减弱，而突触形成、神经递质运输、神经元发育和轴突发育相关程序逐渐增强。
区别在于，这一次研究人员并不是用不同培养皿拼接出一条时间轨迹。
他们是在反复观察同一批活细胞。
慢变化能不能测，那么快速变化呢？
研究人员进一步使用原代人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）构建三维细胞球，并用肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha, TNF-α）进行刺激。
仅仅14小时后，培养液中的VLP RNA已经记录到明显的转录变化。
经典的TNF-α/NF-κB信号相关基因明显升高。
更有意思的是，当研究人员将三维细胞球与传统二维单层培养进行比较时，发现有113个差异表达基因只在三维细胞球中出现。
其中包括与细胞黏附和细胞骨架相关的ICAM1、ACTG1和VAPA，以及参与炎症转录或表观遗传调控的IL8、TNFAIP2、KLF7、BRD3、TRIM56、BCL6B和CCL5等。
这给出了另一个值得思考的信息：
我们有时认为二维培养和三维培养之间的差别只是“模型更像不像组织”。
但如果一个生物学反应只有在三维结构中才呈现，那么空间结构本身就是生物学变量。
而对于类器官（organoid）、细胞球、组织工程模型等难以反复取样的体系，无损检测的价值会进一步放大。
真实组织和复杂培养体系通常不只有一种细胞。
于是出现第二个问题：
如果不同细胞都在向培养液释放VLP，我们怎样区分它们？
研究人员给不同细胞产生的VLP装上了不同的“表面标签”。
例如，让HEK293T细胞产生带FLAG标签的VLP，让HT1080细胞产生带HA标签的VLP。两种细胞混合培养后，可以利用FLAG或HA特异性免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）分别捕获两类颗粒。
RNA-seq随后能够重新富集出对应细胞类型的转录特征。
这使“细胞自我报告”从单一总体检测进一步走向了多路复用（multiplexing）：
同一个复杂体系中，不同细胞可以发送具有不同身份标签的分子信息。
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值得继续关注的是：未来能否在一个长期培养的复杂组织模型中，同时持续追踪多种细胞各自的状态变化？ |
前面的实验已经说明，天然Gag存在RNA包装偏好。
研究人员没有把这种偏好简单视为缺陷，而是尝试对它进行工程化改造。
一个方向是将Gag与RNA结合蛋白（RNA-binding protein, RBP）融合。
例如，将能够识别mRNA 5′端帽结构的eIF4E与Gag融合，形成Gag-eIF4E。
结果相当明显。
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Gag-eIF4E产生的培养液样本平均能够检测到1.47倍更多的基因。 对于蛋白编码基因，培养液与细胞裂解物之间的相关性达到r=0.863。 |
更直观的是，如果比较培养液和细胞裂解物之间出现多少“假性差异”：
普通Gag条件下，有988个基因显著升高、1,203个显著降低；而Gag-eIF4E条件下，这两个数字分别下降到557和476。
也就是说，培养液转录组与细胞内部转录组之间的偏差明显缩小。
在利用培养液判断HEK293T与HeLa细胞差异表达基因的ROC分析中，普通Gag的曲线下面积（area under the curve, AUC）为0.641，Gag-eIF4E则提高到0.860。
研究人员甚至进一步改造MS2/MCP系统，使特定CROP-seq转录本在培养液中相对于细胞裂解物富集约12倍；读取sgRNA文库组成时，Gag-MCP获得的相关性达到r=0.822，而普通Gag只有r=0.477。
这意味着VLP不是一个固定不变的RNA采样器。
它可以被工程化。
未来完全可能针对不同研究目的，设计不同的RNA包装偏好。
研究最后进入了微生理系统（microphysiological system, MPS）。
这类微流控模型可以模拟血管形成、组织微环境以及细胞之间的相互作用，但有一个现实问题：细胞被封闭在复杂装置内部，反复取出细胞进行RNA-seq非常困难。
研究人员让表达Gag-eIF4E的HUVEC分别与两类基质细胞共培养：
正常人肺成纤维细胞（normal human lung fibroblasts, NHLFs），以及子宫内膜基质细胞（endometrial stromal cells, ESCs）。
整个实验持续7天，每天从灌流液中收集一次VLP。
从第3天开始，每个样本中能够检测到超过10,000个基因。
这里有一个很实际的数字值得注意。
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细胞自我报告方案：每种基质条件使用3个MPS装置，总共6个装置，连续追踪7天。 传统破坏性取样：为了获得相同时间序列，需要42个独立装置。 |
而且，由于同一个装置能够被重复检测（repeated measures），分析可以控制不同装置之间的初始差异。
利用广义加性模型（generalized additive model, GAM），研究人员识别出1,472个在两种基质环境中具有共同时间变化的基因；如果采用相互独立样本的统计设计，只能识别出1,363个。
进一步比较两种基质环境，则发现232个基因具有不同的时间变化轨迹。
例如，在肺成纤维细胞环境中，TGF-β信号和内皮屏障建立相关程序随时间增强，提示内皮细胞逐渐从活跃出芽向更成熟的状态转变。
而在子宫内膜基质细胞环境中，MYC、活性氧（reactive oxygen species, ROS）和氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OxPhos）相关程序持续增强，更符合一种高增殖、高代谢活性的血管状态。
如果只在第7天做一次终点RNA-seq，其中相当一部分信息很可能会消失。
因为两个系统最终即使到达相似状态，到达这个状态的路径也可能完全不同。
过去二十多年，组学技术最显著的发展方向之一是不断增加“维度”。
从bulk RNA-seq到单细胞RNA-seq，我们获得了细胞异质性；空间转录组（spatial transcriptomics）进一步告诉我们这些细胞在哪里。
但时间一直是一个更棘手的维度。
大量所谓的“动态轨迹”，其实是利用不同细胞、不同动物或者不同培养物在多个时间点进行重建。
Cell这项研究提供的是另一种实验范式：
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让同一个生物学系统持续存在，同时不断把分子状态读取出来。 |
这对于药物反应尤其有吸引力。
一种药物可能在2小时触发应激，在12小时启动代偿，在48小时导致细胞命运改变。如果只测一个终点，我们看到的可能只是最终结果，而不是导致结果发生的过程。
对于类器官、胚胎样结构、微生理系统、组织工程模型，以及某些难以反复取样的细胞群体，这种差别可能尤其重要。
这项技术目前仍有几个非常明确的局限。
首先是灵敏度与时间分辨率之间的矛盾。
单个HT1080细胞培养24小时后，培养液中平均只能检测到589±63个基因；100个细胞能够增加到1,866±22个基因。虽然单细胞级别已经可以检测到RNA，而且与细胞裂解物的表达相关性达到r=0.61，但距离完整、稳定的单细胞转录组仍有明显差距。
因此，这篇研究后续的大部分实验实际上使用的是10万个以上细胞，VLP累积时间通常至少12小时。
这直接带来第二个问题：
VLP RNA不是某一瞬间的转录组。
传统RNA-seq更接近取样瞬间的“截面”；而VLP中的RNA是过去一段时间不断产生、包装并释放之后的时间积分信号（time-integrated signal）。
一个持续30分钟的剧烈转录脉冲，完全可能在12小时累积窗口中被稀释。
第三，VLP对RNA存在细胞质偏好和序列相关的包装偏好，因此不能简单假设培养液RNA与完整细胞RNA完全等价。
此外，目前这套体系需要对细胞进行遗传工程改造，使其表达Gag或Gag融合蛋白。这意味着它现阶段最自然的应用场景仍然是可工程化的细胞、类器官和体外模型，而不是直接替代临床样本的常规转录组检测。
这些局限并不会削弱这项研究的价值，反而帮助我们更准确地理解它究竟解决了什么问题。
这项工作的意义，可能并不是再发明一种RNA-seq。
更准确地说，它改变了样本与检测之间的关系。
传统实验通常是：
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培养 → 处理 → 取样 → 结束 |
而细胞自我报告允许另一种设计：
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培养 → 处理 → 读取 → 继续培养 → 再读取 → 再干预 → 再读取 |
同一个样本因此可以同时拥有过去、现在以及未来。
这会产生一些过去很难直接回答的问题：
一个细胞群体什么时候开始偏离正常轨迹？药物作用最早在哪个时间点出现？一次短暂刺激留下的转录变化能够维持多久？不同微环境最终产生相似表型时，它们经历的分子路径是否相同？
Najia等人的研究并没有回答这些问题。
但它提供了一种让这些问题变得可以被实验直接追踪的技术框架。
过去，我们经常通过终点推测过程。
如果活细胞能够持续把自己的分子状态“报告”出来，那么未来的转录组研究，也许会越来越关注另一件事：
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细胞表达了什么固然重要，但它是什么时候开始改变、改变了多久，以及下一步将走向哪里，可能同样重要。 |
参考文献
