只知道“谁是谁的后代”，还不够
研究肿瘤演化，一个经典思路是构建系统发育树（phylogenetic tree）。
如果两个癌细胞共享大量遗传标记，我们就可以推测它们拥有共同祖先；如果某个分支快速扩大，则意味着一个亚克隆（subclone）可能获得了生长优势。
问题在于，传统谱系分析往往缺少一个很重要的信息：这些细胞当时到底在哪里？
空间转录组学解决了另一个问题。它能够告诉我们，组织的不同位置表达哪些基因、有哪些细胞状态、免疫细胞和成纤维细胞如何分布。但仅凭空间表达信息，又很难准确回答一群癌细胞之间是否存在直接的演化关系。
这项研究把两类信息放在了同一套实验体系中。
研究人员使用Kras;Trp53驱动的肺腺癌KP-Tracer小鼠模型。肿瘤启动的同时，Cas9也开始在预设的基因组靶点产生不可逆、能够遗传给子代细胞的插入或缺失（indels）。随着癌细胞不断分裂，这些编辑逐渐累积，相当于给不同细胞留下了一串可以追踪的谱系记录。
随后，研究人员使用两种互补技术读取这些信息。
Slide-seq能够在约10 μm的近细胞尺度分析连续组织区域，一次可覆盖最高约1 cm × 1 cm；Slide-tags则进一步获得单细胞核水平的转录信息和空间位置。
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最终，研究共获得44个Slide-seq阵列和5个Slide-tags阵列，覆盖超过100个肿瘤组织切片。 |
换句话说，他们不只是拍下了一张肿瘤的空间“照片”，还试图在照片中的每一个位置追问：
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这里的癌细胞来自哪里？和旁边的细胞是什么亲缘关系？它现在处于什么状态？周围又有哪些免疫细胞和基质细胞？ |
空间数据有缺口，他们先补上了癌细胞的“家谱”
这套技术首先面临一个现实问题：空间转录组并不能完整捕获所有谱系标记。
研究中，谱系靶点的捕获率在Slide-seq中约为30%，Slide-tags约为59%，明显低于此前液滴式单细胞RNA测序实验中约80%的水平。
如果大量谱系信息缺失，系统发育树就可能出现断点。
研究人员因此利用一个很直观的空间规律：在较小的局部区域内，相邻癌细胞往往具有相近的谱系状态。基于这一点，他们根据周围细胞的信息，对缺失的谱系标记进行空间推断（spatial imputation）。
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在保留数据测试中，这种方法的中位推断准确率达到90%；不同数据集中可以恢复4%～58%的缺失数据，平均约31%。 |
不过，这一点也值得注意。
空间相邻并不总意味着谱系相近。癌细胞如果发生迁移，两个今天相邻的细胞可能并没有很近的亲缘关系。作者因此明确指出，细胞迁移是空间推断需要特别注意的局限之一。
这也为后面的结论设定了一个重要前提：这张肿瘤“家谱地图”很有信息量，但它仍然是一种经过实验数据和计算推断共同重建的结果。
一个肿瘤内部，其实存在完全不同的“生态区域”
当空间位置、谱系和基因表达被放在一起后，肿瘤内部的结构开始变得清晰。
研究人员在Slide-seq数据中识别出11种反复出现的空间基因表达群落（spatial gene expression communities）。
其中包括以Sftpc为代表的肺泡样（Alveolar）程序、以Vim、Myc和Hmga2为特征的EMT程序、以Slc2a1/GLUT1为代表的缺氧（Hypoxic）程序，以及与纤维化、炎症、巨噬细胞和胃样/内胚层样状态有关的多个空间程序。
一个非常稳定的趋势出现了：
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较早期、更加接近AT2-like状态的癌细胞倾向于位于肿瘤外缘；而肿瘤内部则更多出现高侵袭性的癌细胞、免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）和肌成纤维细胞样癌相关成纤维细胞（myofibroblast-like CAFs, myCAFs）。 |
更有意思的是，这些变化不是相互独立的。
在不同肿瘤中，EMT、缺氧和成纤维细胞相关空间程序的丰度高度相关，Spearman相关系数达到0.9；与此同时，它们与较早期的肺泡样程序和炎症程序呈相反趋势。
于是一个问题自然出现：
究竟是恶性程度更高的癌细胞主动选择了缺氧区域，还是某些癌细胞首先发生快速扩张，随后改变了周围环境，最终把自己推向更具转移能力的状态？
亚克隆一旦快速扩张，肿瘤内部开始“变天”
为了回答这个问题，研究人员引入了两个重要指标。
一个是系统发育适应度（phylogenetic fitness），它反映某条癌细胞谱系相对扩张速度；另一个是克隆可塑性（clonal plasticity），衡量一条谱系在演化过程中经历过多少次细胞状态转换。
结果非常有启发性。
高适应度、发生快速扩张的亚克隆，更容易位于肿瘤内部，并与缺氧、EMT以及纤维化程序共存；而较低适应度、较早期的癌细胞则更多留在肿瘤外缘。
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研究将适应度最高10%和最低10%的细胞各取499个进行比较，高适应度细胞距离肿瘤外缘显著更远，P < 1×10⁻⁵。 |
更重要的是，数据提示这些事件可能具有时间顺序。
在肿瘤演化序列中，缺氧程序通常早于EMT程序出现。免疫荧光结果也显示，GLUT1代表的缺氧区域似乎先出现，随后才出现更多ARG1阳性的免疫抑制性髓系细胞。
因此，研究人员提出了一种模型：
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癌细胞首先经历状态可塑性的增加，其中部分亚克隆获得生长优势并迅速扩张；随着肿瘤内部细胞密度增加和结构改变，形成缺氧区域；缺氧进一步影响巨噬细胞和成纤维细胞，使微环境向免疫抑制和纤维化方向重塑；最终，这些外部条件又反过来推动癌细胞进入低可塑性、更加稳定的促转移EMT状态。 |
这里最值得注意的是：癌细胞的“恶化”与周围环境的“恶化”，可能不是两条平行路线，而是在相互推动。
缺氧并不够：癌细胞需要周围细胞一起“推一把”
但空间共存仍然只能说明关联。
为了进一步检验机制，研究人员进行了3D肺肿瘤类器官（organoid）共培养实验，把癌细胞与肺泡巨噬细胞、肺间充质细胞组合起来，同时改变氧浓度。
结果出现了一个很有意思的差异。
单独缺氧时，癌细胞的肺泡上皮标志物有所下降，早期间质标志物Vim略有增加，但关键EMT转录因子Twist1没有明显变化。
只有共培养，也没有缺氧时，癌细胞反而保持了更明显的上皮特征。
而当缺氧与巨噬细胞、间充质细胞共培养同时存在时，EMT反应明显增强。
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Vim和Twist1等经典EMT指标的诱导程度，比单纯缺氧高出2.5倍以上。 |
这使整个故事向前推进了一步。
缺氧可能并不是简单地直接把癌细胞“变成”转移细胞。更符合这些实验结果的解释是：缺氧首先改变细胞间的交流环境，而被重新塑造的巨噬细胞和成纤维细胞，再与缺氧共同作用于癌细胞。
研究进一步发现了多组在扩张区域增强的配体—受体（ligand–receptor）信号。
癌细胞可以通过Il34::Csf1r等信号促进巨噬细胞募集，通过Bmp7::Acvr1等通路推动免疫抑制状态；同时还可与成纤维细胞共同促进细胞外基质重塑。反过来，TAM和CAF又通过Fn1::Cd44、胶原—整合素以及TGFβ相关信号影响癌细胞。
因此，肿瘤内部并不是“癌细胞+旁观者”。
癌细胞、缺氧、免疫细胞和基质细胞形成了一个不断重构的相互作用网络。
小鼠中的故事，在人肺腺癌里能找到吗？
动物模型中看到的现象，如果在人类肿瘤中完全不存在，其意义显然会大打折扣。
研究人员因此进行了多层验证。
首先，他们分析了12例KRAS突变人肺腺癌手术切除样本。结果发现，缺氧标志物GLUT1、EMT标志物VIM以及免疫抑制相关蛋白SPP1在空间上显著共定位，Fisher精确检验P < 1×10⁻⁵。SPP1与巨噬细胞标志物CD68的重叠还提示，大量SPP1阳性细胞来自巨噬细胞。
随后，研究人员整合了56例患者的空间转录组数据，包括30例LUAD、10例非典型腺瘤样增生（AAH）、12例原位腺癌（AIS）和4例微浸润性腺癌（MIA）。
在已经发展为LUAD的组织中，缺氧相关基因SLC2A1与多个进展相关程序空间共现，包括增殖标志物MKI67、TGFβ信号、EMT相关SNAI2，以及免疫抑制巨噬细胞相关的SPP1和FCGR2B。
但这里还有一个值得思考的结果：
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在尚未发展为LUAD的早期病变中，并没有观察到同样明显的模式。 |
这意味着，“缺氧—免疫抑制—EMT”组合可能不是肿瘤一开始就具备的固定属性，而可能是在肿瘤演化过程中逐渐建立起来的空间生态结构。
最终发生转移的细胞，原来集中在原发肿瘤的一小块区域
这项研究最有吸引力的一部分，是直接追踪转移来源。
研究人员分析了一只存在广泛转移的KP-Tracer小鼠，其转移灶涉及纵隔淋巴结、肋部和膈肌。
通过不同组织层面的谱系信息对齐，他们发现，这些不同位置的转移灶都与原发肺肿瘤T2内部一个空间上高度集中的亚克隆具有明确的谱系关系。
这个区域并不是普通的肿瘤组织。
与同一原发肿瘤中的非转移起始区域相比，它含有更多EMT和缺氧程序，并富集Vim、Arg1、TGFβ信号以及Cthrc1等纤维化相关表达。
更值得注意的是，不同转移灶共享一个共同的谱系indel状态。
由于空间数据仍存在稀疏性，研究人员明确表示，目前无法准确计算究竟发生了多少次转移播散事件。基于共享谱系标记以及该模型中转移相对少见的特点，作者认为最简约的解释是：这些转移可能起源于T2中的一个共同亚克隆，随后再发生二次播散。
因此，这项研究没有证明“所有转移都来自单个细胞”。
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它真正提供的证据是：至少在这个模型中，远处转移并不是从整个原发肿瘤随机产生，而可以追溯到一个具有特定空间位置、谱系背景和微环境状态的亚克隆区域。 |
到达远处之后，转移灶还会继续改造自己的环境
转移并不是癌细胞离开原发灶后故事就结束了。
与原发肿瘤中的转移起始亚克隆相比，远处转移灶仍然保持了相似的EMT和TGFβ程序。
TGFβ信号在两者之间的差异为log₂FC = −0.14，P = 1.0，也就是说，这组数据没有显示两者存在明显差异，提示这一程序在播散后仍被维持。
但胶原相关基因出现了非常明显的进一步升高：
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log₂FC = 3.81，P < 1×10⁻⁵ |
换算一下，23.81约为14倍。
这提示癌细胞抵达新的组织后，并不是简单复制原发灶的微环境，而可能进一步建立更加富含胶原和纤维化的转移生态。
另一组包含56例人肺腺癌患者、其中34例脑转移的单细胞RNA测序数据，也显示远处转移灶仍保持较高水平的胶原沉积、TGFβ、缺氧感知、免疫抑制性髓系细胞募集和EMT等转录程序。
但反向检查同样重要：研究中并非所有转移灶都表现出一致程度的胶原增加。与周围正常组织相比，只有约一半样本显示明显增加的胶原沉积。
因此，“转移一定伴随强烈纤维化”显然不是这项研究能够支持的结论。
这项研究改变的，不只是我们怎么看“转移”
如果把全部结果串起来，一个更完整的肺腺癌演化过程开始浮现：
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早期癌细胞逐渐脱离AT2-like状态，细胞状态可塑性增加；某些亚克隆随后获得更高适应度并快速扩张；扩张重塑肿瘤内部空间结构，缺氧逐渐出现；免疫细胞和成纤维细胞发生状态变化，免疫抑制和纤维化增强；细胞间信号被重新组织；癌细胞最终进入更加稳定的EMT样促转移状态；其中部分空间集中的亚克隆获得播散能力，并在远处继续建立适于生长的微环境。 |
研究较有力地建立了亚克隆扩张、空间位置、缺氧、免疫抑制、纤维化、EMT和转移谱系之间的联系，并通过类器官共培养对部分机制进行了验证；但主要的时空演化证据仍来自Kras;Trp53驱动的小鼠肺腺癌模型。人类样本提供了重要支持，却没有进行同等条件下的动态谱系追踪。
研究人员也明确指出，缺氧如何具体塑造不同免疫和基质细胞亚群、这些变化之间究竟包含多少直接因果关系，仍需要进一步的机制实验。
这恰恰留下了一个更值得思考的问题。
过去我们常把癌症进展理解为：癌细胞不断获得新的恶性特征，所以越来越容易转移。
而这项研究提示，另一种视角可能同样重要：
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一个癌细胞是否最终获得转移能力，不只取决于“它自身变成了什么”，还取决于“它在什么位置生长、它的亚克隆如何扩张，以及它和周围细胞共同塑造出了什么样的环境”。 |
如果这一模型在更多人类肿瘤中得到验证，那么未来值得关注的可能不只是已经完成EMT、准备播散的癌细胞。
更早出现的亚克隆快速扩张、局部缺氧以及免疫和基质重塑，或许才是肿瘤从局部生长走向转移之前，更值得研究的时间窗口。
而这也让肿瘤研究中的一个老问题有了新的表达方式：
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我们究竟是在治疗一群不断突变的癌细胞，还是在干预一个由癌细胞、空间结构和微环境共同演化的生态系统？ |
参考文献
